CONQUEST-2 (Genes CONtrolling QUantitativE traits of Solanum Tuberosum)

Laufzeit: 01. 04. 2004 bis 31. 03. 2007

Projekt Koordinatorin:
Dr. PD Christiane Gebhardt, Max-Planck Institut für Züchtungsforschung, Carl von Linné Weg 10, 50829 Köln (MPIZ)

Projektpartner:
Böhm-Nordkartoffel-Agrarproduktion OHG, Wulf-Werum-Str. 1, 21337 Lüneburg (BNA).

Projektleiter:
Dr. Hans-Reinhard Hofferbert.
Saka-Ragis Pflanzenzucht GbR, Zuchtstation Windeby, 24340 Eckernförde (SARA).

Projektleiter:
Dr. Jens Lübeck.
RZPD German Resource Center for Genome Research, 14059 Berlin (RZPD).

Projektleiterin:
Dr. Svenja Meyer.

Projektziele:

• Die molekulare Identifizierung von Genen für quantitative Resistenz gegen Pathogene, die sehr wichtig für den Kartoffelanbau sind. Diese Pathogene sind Phytophthora infestans, der Erreger der Kraut und Knollenfäule und der Wurzelnematode Globodera pallida.
• Entwicklung und Erprobung von diagnostischen, molekularen Markern zur Evaluierung phänotypischer und genotypischer Biodiversität der Kartoffel im Hinblick auf Pathogenresistenz im Allgemeinen und Resistenz gegen Phytophthora infestans und Globodera pallida im Besonderen.
• Evaluierung von Marker-gestützter Züchtung auf quantitative Resistenz gegen Phytophthora infestans und Globodera pallida im Rahmen und unter den Bedingungen kommerzieller Kartoffelzuchtprogramme.
• Entwicklung eines lokalen Datenbank Applikations-Tools, das die Speicherung von Daten in strukturierter Form und deren effiziente Analyse ermöglicht, z. B. die computergestützte Ableitung von Haplotypen und eine Korrelation zwischen Haplotyp und Phänotyp in polyploiden Nutzpflanzen.

Voraussetzungen

In der 1. Projektphase (CONQUEST-1, 1999-2003) wurden 1498 SNP (single nucleotide polymorphism) und 127 InDel (Insertion/Deletion) Marker identifiziert, die physikalisch mit Kandidatengenen für Pathogenresistenz (Gene vom Typ NBSLRR) gekoppelt sind. Diese Marker markieren die meisten der bekannten, Resistenz-QTL enthaltenden Regionen des Kartoffelgenoms. Erste SNPs, die mit Resistenz gegen G. pallida gekoppelt sind, wurden identifiziert und in Haplotyp-spezifische Marker Tests umgewandelt. Für einen "h  spot" für Resistenz auf Chromosom V, der QTL sowohl für Resistenz gegen P. infestans als auch für G. pallida enthält, wurde eine physikalische Karte von 400 kb erstellt. Davon wurden ca. 350 kb vollständig sequenziert. Eine Datenbank PoMaMo (Potato Maps and More) wurde etabliert in Zusammenarbeit mit RZPD (Berlin) im Rahmen des GABI 1 Projekts "GABI Primary Database (GabiPD)". Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für die 2. Projektphase.

Arbeitsplan

Eine Population von nur entfernt miteinander verwandten tetraploiden Kartoffel-Zuchtklonen wird für SNP/InDel Marker genotypisiert, die eng mit Resistenzloci gekoppelt sind. Die Genotypisierung erfolgt durch Sequenzierung von PCR Fragmenten, wodurch eine Bestimmung der Alleldosis in tetraploiden Kartoffeln sowie die Ableitung von Haplotypen an einem bestimmten Locus möglich ist. Allegenotypischen Daten werden in die GABI Primärdatenbank (GabiPD) integriert. Ein lokales Datenbank Applikations Tool, das in diesem Projekt entwickelt wird, erlaubt dem Nutzer, Daten in strukturierter Form zu speichern, zu analysieren und zu interpretieren. Mit diesem Tool ist es möglich, Daten in eine lokale Datenbank zu importieren, und in standartisierten Formaten zu exportieren, um den Datenaustausch zwischen kooperierenden Partnern zu erleichtern. In Zusammenarbeit mit dem geplanten GABI2 Projekt GABI-BRAIN (koordiniert von Prof. Dr. A. Melchinger, Universität Hohenheim) wird ein Werkzeug für die Haplotypisierung von polyploiden Arten mittels eines bioinformatischen Ansatzes entwickelt.

Die gleiche Population von tetraploiden Zuchtklonen wird in wiederholten Feldversuchen auf quantitative Resistenz gegen P. infestans im Zusammenhang mit anderen agronomischen Merkmalen evaluiert. Die genotypischen Daten werden dann auf Assoziation mit quantitativer Feldresistenz geprüft. Eine mögliche Substruktur der Population wird durch Genotypisierung mit Markern aufgedeckt, die über alle zwölf Chromosomen verteilt sind.

Zusätzliche, Haplotyp-spezifische PCR Tests werden entwickelt für Resistenz-QTL gegen P. infestans und G. pallida. Die Marker werden eingesetzt zur Markergestützten Selektion resistenter Pflanzen unter den Nachkommen der Kreuzungen, die aus dem genetischen Material von CONQUEST-1 stammen. Danach wird der Resistenz-Phänotyp der selektierten Pflanzen mit konventionellen Methoden geprüft. Zugleich wird die Häufigkeit der mit Resistenz-QTL gekoppelten, Haplotypspezifischen Marker in der Population tetraploider Zuchtklone bestimmt. In Kombination mit der phänotypischen Evaluierung dieser Population auf quantitative Resistenz wird der diagnostische Wert der Marker in genetisch diversem Zuchtmaterial geprüft. Aufbauend auf diesem genotypischen Screening werden neue Kreuzungskombinationen selektiert.

Der sequenzierte Genomabschnitt in dem "hot spot" für Resistenz auf Chromosom V enthält mindestens 35 mögliche Gene. Ob und welche dieser Gene unter dem Einfluß einer Infektion mit P. infestans exprimiert werden, wird durch Hybridisierung von genomischen Array Filtern mit cDNA von infizierten bzw. nicht-infizierten Blättern resistenter bzw. anfälliger Pflanzen analysiert. Mögliche offene Leseraster werden mittels RT-PCR auf Expression getestet. Aufgrund von Expressionsstudien und/oder möglicher Funktion werden Kandidatengene ausgewählt. Deren Haplotypen werden in selektierten Subpopulationen hoch resistenter bzw. hoch anfälliger Genotypen untersucht. Die Identifizierung von Haplotypen mit einer signifikant verschiedenen Häufigkeit in den beiden Subpopulationen ist ein weiteres Indiz für eine ursächliche Rolle des betreffenden Kandidatengenes für die Resistenz.

Schließlich werden Kandidatengene mit Hilfe der siRNA (small interfering RNA) Technologie in einem hoch resistenten Genotyp spezifisch ausgeschaltet. Wenn das betreffende Kandidatengen ursächlich an der Ausprägung der Resistenz beteiligt ist, werden die transgenen Pflanzen eine signifikant höhere Anfälligkeit gegen P. infestans zeigen.